Seperti orang-orang Katolik lainnya, para anggota berusaha menjalankan semangat penyangkalan diri dalam hidup mereka. Sesuai dengan usaha untuk mencari Tuhan dalam kegiatan hidup sehari-hari, Opus Dei menganjurkan untuk mempersembahankan korban-korban yang kecil dalam memenuhi tugas hidup secara baik, dengan mendahulukan kepentingan orang lain di atas kepentingan pribadi, dan berusaha senyum ketika menghadapi keadaan yang tidak menyenangkan.. Selain itu, seperti yang disarankan oleh Gereja Katolik, para anggota dalam beberapa kesempatan mempraktekkan beberapa matiraga fisik, seperti berhenti mengkonsumsi makanan atau minuman tertentu. Sesuai dengan semangat ini, para anggota numerari dan assosiate (anggota-anggota selibat ) kadang-kadang mempraktekkan penitensi yang dikenal dalam Tradisi Gereja, misalnya menggunakan cilice dan discipline. Inilah praktek-praktek yang telah dilaksanakan orang-orang Katolik selama berabad-abad dan menjadi hal yang biasa dalam kehidupan para santo dan santa, seperti: St Fransiskus Asisi, St Thomas More, St Theresia Lisieux, St Padre Pio serta Ibu Teresa. Motif dari praktek penitensi yang dijalankan dengan rela hati ini adalah untuk meniru Kristus dan ikut serta dalam kurban penebusan yang dilakukan-Nya (Mat 16:24). Praktek ini bisa juga merupakan satu jalan untuk menderita dalam solidaritas dengan banyak orang miskin dan mereka yang berkekurangan di dunia ini.